Serum Proteinlerinin Tayininde Uygulanan Yöntemler

Elektroforez Serum Proteinlerinin Tayininde Uygulanan Yöntemler

Elektroforez

Serum Proteinlerinin Tayininde Uygulanan Yöntemler

Serum proteinlerini birbirlerinden ayırmak için büyüklük, kütle,  elektrik yükü veya diğer moleküllere olan affinite gibi özelliklerinin farklılığından yararlanılmaktadır. Serum total proteini ve albuminin miktar tayininde ilk kullanılan yöntemlerden biri “Biüret Reaksiyonu” dur. Bu yöntemde önce total protein tayin edilmekte; sonra globulinler doymuş yada yarı-doymuş bir tuz çözeltisi (Na2SO4 gibi) ile çöktürülüp çözeltideki albumin tayin edilmektedir. Biüret reaksiyonunda, proteinler alkali-bakır tartarat çözeltisi ile eflatun renkli bir kompleks oluşturmaktadır.

% Total Protein – % Albumin= % Total  Globulin Eşitlikten total globulin miktarı gr olarak hesaplanır. Günümüzde albumini direkt tayin eden yöntemler bulunmaktadır.

1. Fraksiyonel Çöktürme,

2. Diyaliz ve Ultrafiltrasyon

3. Kolon Kromatografisi

a) İyon değiştirici kolon kromatografisi,

b) Affinite kromatografisi,

c) HPLC (Yüksek performanslı sıvı kromatografisi)

d) Jel filtrasyonu

4. Elektroforez

a) Kağıt elektroforezi,

b) Nişasta jel elektroforezi,

c) Selüloz-asetat elektroforezi (rutinde en sık kullanılan),

d) Agar-jel elektroforezi,

5. Ultrasantrifügasyon

Elektroforez tipleri: Sellüloz asetat elektroforezi (CAE), Agar – Agaroz jel elektroforezi (AGE), Yüksek rezolüsyonlu elektroforez (HRE), Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE), Disk elektroforez, İzoelektrik odaklama (IEF), Kapiller elektroforez (CE), İki boyutlu elektroforez (2D), Blotting teknikleri.

Elektroforez uygulama alanları

Spesifik protein elektroforezi: Albumin, gamma globulin gibi spesifik serum protein sınıflarının ölçümü, Hemoglobin ve hemoglobin alt sınıflarının tanımlanması, ölçümü, Serum ve idrarda monoklonal proteinlerin tanımlanması ve Temel lipoprotein sınıflarının ayrılması ve ölçümü

İzoenzim analizleri: Kreatin kinaz, laktat dehidrogenaz, alkalen fosfataz

İmmünoelektroforez:  Spesifik immun globulin sınıflarında artma ve azalmaların belirlenmesi

Western blot tekniği: spesifik bir proteini tanımlamak, HIV virüsü

Southern blot teknikleri: spesifik nükleik asid dizilerini tanımlamak (DNA veya RNA)

Elektroforez, yüklü partiküllerin elektriksel bir alanda hareket etmesidir.

Elektroforez ortamını oluşturan bileşenler: Uygun destek ortamı, Tampon ve Elektriksel alan.

Proteinler,

Amfoterik yapıda moleküllerdir. Asid pH’da ( + ) yüklüdürler. Alkali pH’da ( – ) yüklüdürler. İzoelektrik noktada (pI ) yüksüzdürler.

Elektroforez nedir?

Elektrikle yüklü partiküllerin, iletken bir ortamda elektrik alanı uygulanarak hareket ettirilmesine elektroforez denmektedir. Elektrolit ya da tampon olarak da adlandırılan iletken ortam sıklıkla akışkan bir tampon çözeltisi ile sağlanmaktadır. Elektroforetik ayırım, iletken olmayan sellüloz asetat, agaroz veya poliakrilamid jel gibi bir destek ortamında yapılmaktadır. Protein elektroforezi çeşitli patolojik durumlarda farklı serum protein konsantrasyonlarındaki değişimler hakkında bilgi edinmek amacıyla kullanılmaktadır.

Elektroforez Türleri

Sellüloz asetat: Protein, hemoglobin, lipid elektroforezinde kullanılmaktadır.

Agaroz jel elektroforezi: Çok yaygın bir kullanım alanı vardır.

İmmunokimyasal yöntemler

  Antijen-antikor kompleksi oluşumu ölçülmektedir.

–İmmunodiffüzyon

–Elektrokemiluminesans

–İmmunelektroforez

–İmmunoturbidimetri

–immunonefelometri

İMMUNOPRESİPİTASYON: Radyolabelled proteinler antikor ile inkübe edilir. Antikor ilgili protein ile bir kompleks oluşturur. Bu antijen-antikor kompleksleri antikoru bağlayan boncuklarla toplanır. Daha sonra boncuklar kaynatılır ve antijen-antikor komplekslerinden ayırılır.Daha sonra elde edilen proteinler SDS-PAGE ile analiz edilir. Immunopresipite edilmiş olan protein otoradyografi ile görünür hale getirilir.

SDS-PAGE: SDS-PAGE ile proteinler moleküler büyüklüklerine göre ayırılabilirler ve  jelden bir membran üzerine aktarılırlar. Bu membran filtre istenilen proteine yönelik bir antikor protein ile inkübe edilince antikor membrandaki proteinine bağlanır. Membrandaki antikor bu antikora bağlanabilen radyoaktif bir prob yardımıyla görünür hale getirilir.

Tampon

Tamponlar elektroforezde iki amaçla kullanılmaktadırlar:

1.Ortam pH’ını sabit tutarak, elektroforez süresince net bir protein yükü sağlamak,

2.Uygulanan akımı taşımak

Tamponun üç özelliği protein göçü üzerinde etkili olmaktadır:

1.pH

2.Konsantrasyon

3.İyonik güç

Destek ortamı: Elektroforez işleminde araştırılacak molekül yapısına göre, çeşitli destek ortamları kullanılabilmektedir. Önceleri sıvı olan destek ortamları, yerini sellüloz asetat ve çözünmeyen jellere bırakmıştır. Mekanik olarak desteklenmiş olan sellüloz asetat plak ve agaroz jel klinik laboratuvarlarda en çok kullanılan destek ortamlardır. Göç edecek moleküllerin yapısına uygun por çapı ve sayısına sahip olmalıdır. Molekül ile etkileşime girmemelidir. Uygulama işleminde zarar görmemelidir.

Lipoprotein elektroforezi: Lipoproteinlerin elektroforetik olarak ayrılması ile hiperlipidemiler fenotiplerine göre ayrılmaktadır. Agaroz jel en yaygın kullanılan destek ortamı olup, sellüloz asetat veya kağıttan daha iyi ayırım gücüne sahiptir. Örnek olarak taze serum veya EDTA’lı plazma tercih edilmelidir. 3-4 hafta öncesinde kullandığı ilaçlara ara verilmelidir.

Sellüloz asetat: Sellüloz zincirlerindeki OH- iyonlarının asetik anhidrid ile tepkimeye girmesi ile oluşur. Yüzeyi (-) yükler ile kaplıdır (OH- ve asetat). Sellüloz zincirinin uzunluğu, por çapı, por oranı çok değişken. Tampon ile ıslanınca porlar dolar ve esneklik kazanır. Kuru iken oldukça kırılgan bir yapısı vardır. Ön ıslatma ve şeffaflaştırma işlemleri gereklidir.

Agaroz jel: Agar: agaroz+agaropektinden m.g. Agaroz yapısında ise agaropektin bulunmaz. Por çapı büyük olan bir destek ortamıdır (Ag-Ab komplekleri için uygun). Proteinlere olan affinitesi sellüloz asetattan fazladır. Ön ıslatma, şeffaflaştırma basamakları yoktur.

ELEKTROFOREZDE KULLANILAN BOYA ÇÖZELTİLERİ

Ayırımı yapılmış proteinleri görünür hale getirmek ve sabitleştirmek amacı ile kullanılırlar. Elektroforez uygulanan proteine, işlemin türüne ve kullanıcı tercihine bağlı olarak seçilirler. Duyarlılıkları mg düzeyinden pg düzeyine kadar değişebilir.

PAGE (Poliakrilamid jel elektroforezi): Bir katalizör yardımı ile, in situ polimerize edilen, farklı yapıdaki jeller ile hazırlanmaktadır. Moleküller yük ve boyutlarına göre ayrılır. Dikey veya yatay elektroforezde kullanılabilir. Isıya dayanıklı yapısı nedeni ile 50-60°C’de sürdürülebilir. RNA, DNA, RF analizinde sık kullanılır.

IEF  (İzoelektrik odaklama): Amfoterik maddelerden oluşturulan bir pH gradienti boyunca, moleküllerin pI değerlerine kadar göç etmeleri sağlanır. Serum proteinleri 40 banda kadar ayrılabilir. 2000 V’a ulaşan yüksek voltajlar kullanılır.

2D (İki boyutlu elektroforez): Karmaşık yapıya sahip olan proteinlerin ayrılmasında yararlı bir tekniktir. 1. boyutta yüke bağlı bir ayırım sağlanırken, 2. boyutta moleküller ağırlıklarına göre ayrılmaktadır.

 

İmmünodiffüzyon ölçüm prensibi Serum Proteinlerinin Tayininde Uygulanan Yöntemler

İmmünodiffüzyon ölçüm prensibi

    Makale Yazarı: duslerkulup2

Sizde yorum yazabilirsiniz...