Elektroforez, yüklü partiküllerin elektriksel bir alanda hareket etmesidir.  Uygulamadaki incelikleri nedeni ile, bir sanat olarak ta değerlendirilen, makromoleküllerden nükleik asidler, restriksiyon fragmanlarına kadar çok geniş bir uygulama alanına sahip olan bir laboratuvar tekniğidir. Böylelikle elektroforez nedir sorusunu cevaplamış olduk.

Uygulama alanları

Spesifik proteinlerin ayrılması, İzoenzim analizleri, İmmunelektroforez, immunfiksasyon elektroforezi ve DNA,RNA, restriksiyon fragmanlarının ayrılmasıdır.

Proteinler, amfoterik yapıda moleküllerdir. Asid pH’da ( + ), Alkali pH’da ( – ) yüklüdürler. İzoelektrik noktada (pI )ise yüksüzdürler.

Elektroforetik göç, Molekülün net yükü, Molekülün boyutu, şekli, Destek ortamının özellikleri, Elektriksel alanın gücü ve sıcaklıktan etkilenmektedir.

Elektroforez ortamını oluşturan bileşenler;  Uygun destek ortamı, Tampon ve Elektriksel alandır.  Destek ortamlarıysa; Sellüloz asetat, Agaroz jel, Poliakrilamid jel ve Nişasta jeldir. Selüloz asetatın por çapı ve oranı çok değişkendir.

TAMPON: Ortam pH’ını sabit tutma, elektroforez süresince net bir yük sağlama ana amaçtır. Uygulanan elektrik akımını taşıma pH aralığı8.0 – 9.0 arasında seçilir. Albumin en fazla (-) yüke sahip iken; Gamma globulinler en az (-) yüke sahiptirler. Daha yüksek pH’da proteinler denatüre olabilirler.

ELEKTROFOREZDE KULLANILAN BOYA ÇÖZELTİLERİ

Ayırımı yapılmış proteinleri görünür hale getirmek ve sabitleştirmek amacı ile kullanılırlar. Elektroforez uygulanan proteine, işlemin türüne ve kullanıcı tercihine bağlı olarak seçilirler. Duyarlılıkları mg düzeyinden pg düzeyine kadar değişebilir.

YORUM

Elde edilen bandlar gözle değerlendirilebilir. Dansitometre: göç eden proteinin, tuttuğu boya miktarına göre, total proteindeki yüzdesini ölçmek amacı ile geliştirilmiş olan spektrofotometrelerdir.

SORUNLAR – HATA KAYNAKLARI

Örnek uygulanmasında yapılan hatalar

Kullanıcı hatası ve Aplikatörün kirli olmasıdır.

Bandlarda şekil bozukluğu:

Örnek yüklenmesinde gecikme, Örneğin destek materyali ile çok uzun süre temas etmesi, Yüksek voltaja bağlı sıcaklık artışı ve Sürenin çok uzun tutulmasıdır.

Örnek kökenli hatalar:

Hemoliz ve Antikoagülan  kullanımı, plazma örneği, ilaç kullanımıdır.

*Herbir çalışma grubunda bir kontrol örneğinin çalışılması, hata kaynaklarının ortaya konması açısından büyük bir önem taşımaktadır. Elektroforezde kalite kontrol basamağı rutin bir işlem olarak değerlendirilmelidir.

Serum Protein Elektroforezi

Plazmada çok farklı yapı ve fonksiyona sahip 500 kadar protein vardır. Bazıları basit polipeptid yapıda, bazıları ise Ig’ler gibi büyük ve kompleks yapıya sahiptir. Plazma proteinleri ifadesi genellikle protein elektroforezi ile görüntülenebilecek kadar yüksek miktarda bulunan proteinleri kapsar.  Protein elektroforezi çeşitli patolojik durumlarda farklı serum protein konsantrasyonlarındaki değişimler hakkında bilgi edinmek amacıyla klinik biyokimya laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

Elektroforetogram

Albumin bandı Albumin proteinini içerirken, a1 bandı a1-lipoprotein (HDL), a1-Antitripsin, a1-Asid Glikoprotein ve a1-Antikimotripsin proteinlerini içeriyor. Ayrıca a2 bandı da Haptoglobin,  a2-Makroglobulin, Serüloplazmin ve  a2-lipoprotein (preb, VLDL) adlı proteinleri içerir. b1 bandı; Transferrin,  b-lipoprotein (LDL) ve Hemopeksin proteinlerini barındırır.  b2 bandı da; b2-Mikroglobulin, C3-kompleman ve Fibrinojen proteinlerinin içerir. Son olarak gama bandıysa İmmunglobulinler (Ig A, G, M, D ve E), CRP ve Plazminojen isimli proteinleri içerir.

 

 

Bazı Patolojik Durumlarda Protein Elektroforezinde Saptanan Tipik Bulgular

	Total Protein	Albumin	Alfa 1	Alfa 2	Beta	Gamma
Akut inflamasyon		¯	­	­		N ¯
Kronik inflamasyon		¯	­	­	N ­	­
Siroz	¯	¯¯		¯	­ Beta-gama ­ köprüsü
Nefrotik sendrom	¯¯	¯¯		­­	­	¯
Hipogamaglobulinemi						¯¯¯
Paraproteinemi	N ­	¯	¯	¯	Anormal bant
a1-antitripsin eksikliği			¯¯

 

SPESİFİK ELEKTROFOREZ PATERNLERİ

Protein kaybı – malnutrisyon

Tüm fraksiyonlarda düşük ( başlıca albumin olmak üzere )

Nefrotik sendrom

Albumin  ve takiben AAT, TRF ve son olarak Ig’ler  düşük

Büyük moleküller olan AMG, b-lipoproteinler, Hp  ­yüksek

Akut faz yanıtı

Hp, AAT yüksek ­ ( CRP artışı genelde SPE’ine yansımaz)

Albumin hafif düşük

Siroz

Albumin  düşük

Tüm Ig’ler  ­yüksek ( Ig A’daki yükselme SPE’de b – g köprüleşmesine yol açar)

Hipogammaglobulinemi

g bölgesinde belirgin düşük

Monoklonal Gammopati

Sentezi artan paraproteine ait dar ve sivri pik ( a2 – g arasında göç edebilir )

Kategori : Eğitim Dünyası