Spektrofotometre Hakkında Geniş Bilgi

spektrofotometre nedir Spektrofotometre Hakkında Geniş Bilgi

Temel Prensipler

Kolorimetri, renkli çözeltilerde renk ölçülmesine dayanan bir laboratuvar ölçüm yöntemidir. Bu yönetmle, madde miktarı bilinen bir standart çözeltinin renk şiddeti ile madde miktarı bilinmeyen  çözeltinin renk şiddeti karşılaştırılarak kantitatif analiz yapılır. Analiz edilen örneğe; ışık denetiminin bir kısmının filtreler kullanılarak ayıran ve gönderen aletler fotometre ya da kolorimetre olarak adlandırılırken, yarıklar ya da prizmalar aracılığıyla bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılır. Kolorimetreler ve spektrofotometreler yalnızca geçen ışık demetinin sınırlanma yolları bakımından birbirlerinden farklıdır. Elektromanyetik ışık, kısa dalga boyundaki gamma ışınlarından uzun dalga boyundaki radyo ışıklarına kadar yayılan ışınlardan oluşmuştur. Tungsten flamadan veya güneş ışığından çıkan bir ışık spektrumudur. Değişik dalga boylarındaki ışıyan enerjinin bir karışımıdır ve göz bunu beyaz olarak algılar. İnsan gözü bu spektrum içinde 400-760 nm dalga boyu arasındaki radiant enerjiye cevap verir (Görünür Spekturum).  400 nm’den kısa olan ışıklara ultraviyole, 760 nm’den daha uzun olanlara ise infraruj denir. Her renkli sıvı, normal ışığı oluşturan ışıklardan bir kaçını daha çok soğurur (absorbsiyon), diğerlerini ise çok az absorplar veya olduğu gibi geçirir (transmisyon). Örneğin, bir çözelti yeşil renkte ise 495-700 nm arasındaki dalga boylarını yansıttığı için yeşildir. Bu sebeple, fotometride kullanılacak olan ışık, renkli sıvının renk tonuna göre değişen, tek renkli bir ışık olmalıdır. Örneğin, kırmızı renkli bir sıvı için yeşil veya mavi renkli bir ışık seçilmelidir. Spektrofotometrinin  kantitatif amaçlarla kullanılabilmesi için ölçümü yapılacak olan söz konusu maddenin maksimum absorbans gösterdiği dalga boylarının saptanması gereklidir. Spektrofotometrinin temel prensibi, bir çözeltinin absorbladığı ışık miktarının ölçülmesi ve bu ölçüm ile çözeltinin konsantrasyonun saptanması  esasına dayanır. Çözeltiye giren ışıkla çıkan ışık arasındaki fark hesaplandığında çözeltinin absorbansı bulunur.

Beer – Lambert Kanunu

Konsantrasyon ve absorbans arasındaki ilişki Beer kanunu ile açıklanmıştır. Buna göre, renkli bir çözeltinin optik dansitesi bu çözeltinni rengini oluşturan maddelerin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. A= Optik dansite (Absorbans) = axbxc      Absorbans  değerinin birimi yoktur.

a: absorbivite (sabite)

b: cm cinsinden ışık yolu

c: g/L cinsinden tanımlanan absorban bileşiğin konsantrasyonu

Genelde absorbans ölçümü yapılıp maddenin konsantrasyonu saptanmak istendiğinden formülü bu şekilde uyarlanmıştır. C= A/ab

Bu konumda da a ve b sabit iki sayı olduğundan absorbans ve konsantrsyon arasındaki lineer ilişki ortaya çıkar, yani konsantrasyon arttıkça absorbansta artış gösterir.

Transmisyon

Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddeti ile karşılaştırılması transmisyon (geçirgenlik) kavramını oluşturur. Renkli bir çözeltinin transmisyonu ile kör çözeltinin transmisyonunun karşılaştırılmasına transmittans denir. Transmittans ile konsantrasyon arasındaki ilişki logaritmiktir. A (optik dansite) ise konsantrasyon ile doğru orantılıdır. Transmittan değerinin (T) 100 ile çarpılması ile (%T) yüzde transmşttans elde edilir. %T= Tx 100 olduğuna göre bu eşitlikten T= %T/100 değeri A= -logT eşitliğindeki yerine konarak: A= -log T=Log 1/T = log100/%T=Log 100-log% =2-log %T

A= 2-log %T denklemi bulunur.

Biüret Yöntemi İle Serumda Protein Tayini

Proteinler Cu+2 iyonları ile alkali ortamda mor renkli kompleks oluştururlar. Protein konsantrasyonu yüksek olan bir çözeltinin biüret reaktifi oluşturacağı renk konsantrasyonuna bağımlı olarak daha yoğun olacaktır. Materyal: Distile su, Protein stok standart çözeltisi, serum fizyolojik, Biüret rekatifi ( Üre+ NAOH+ Na-K tartarat+KI+CuSO4)

Oluşan, 30 dakika sonra renk fotometrede 546 nm’de okunur. Biüret tepkimesi, peptit bağlarının gösterilmesine yarar. Tepkimede iki molekül üreden bir molekül amonyak ve biüret denilen yeni bir madde meydana gelir. Birbirleriyle doğrudan ya da peptit bağı ile bağlanmış 2 karbonil grubu içeren tüm bileşikler, NaOH ve seyreltik CuSO4 çözeltileri ile karıştırılırsa menekşe renk gösterirler. Amino asitler ise Biüret reaksiyonu vermezler.

 

%name Spektrofotometre Hakkında Geniş Bilgi

    Makale Yazarı: duslerkulup2

Sizde yorum yazabilirsiniz...

Kameralı Sohbet